（一）適用范圍
本操作說明適用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等凍存細(xì)胞的復(fù)蘇操作過程。
（二）主要試劑
復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有20%滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，復(fù)蘇1管細(xì)胞用量為30mL。
注：10%-20%滅活FBS均可，推薦20%滅活FBS。
IMDM，DMEM，MEM培養(yǎng)基均可，推薦RPMI-1640培養(yǎng)基。
（三）儀器設(shè)備
恒溫水浴鍋、生物安全柜（超凈工作臺）、離心機(jī)。
注：如無恒溫水浴鍋，用溫度37±3℃溫水亦可。
（四）復(fù)蘇操作流程
打開恒溫水浴鍋，水溫設(shè)置為37℃。
將復(fù)蘇培養(yǎng)基孵育至37℃，在生物安全柜內(nèi)，取9 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基15 mL離心管。
從液氮罐或超低溫冰箱取出凍存管，用鉗子夾住凍存管蓋子邊緣，迅速放入37°C水浴中均勻快速的水平搖晃（勿將管蓋浸入水中），直至凍存管中冰晶完全融解，停止水?。s90s-120s，確定完全融解后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移）。
用75%酒精擦拭凍存管表面以及蓋子，在生物安全柜內(nèi)打開凍存管，并把凍存管內(nèi)溶液用移液器轉(zhuǎn)移到裝有9 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基的15 mL離心管內(nèi)（轉(zhuǎn)移時吸取和打出液體要輕柔緩慢，15s均勻吸取/打出1mL細(xì)胞懸液）。
吸取1 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基洗滌凍存管，再將洗滌液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，按以上步驟重復(fù)洗滌凍存管一次。輕輕吹打5-7次混勻細(xì)胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。
離心后，棄上清，加入復(fù)蘇培養(yǎng)基至10mL，輕輕吹打重懸細(xì)胞，離心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均為9）。
離心后，棄上清，吸去殘留液體，加入復(fù)蘇培養(yǎng)基（根據(jù)計數(shù)需要計算加入復(fù)蘇培養(yǎng)基的體積，如用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，推薦重懸濃度5-10M/mL），輕輕吹打重懸細(xì)胞，避免氣泡。
對重懸均勻的細(xì)胞懸液進(jìn)行數(shù)量和活率測定。
（五）復(fù)蘇注意事項
為避免細(xì)胞損失太大，復(fù)蘇過程盡可能使用15mL離心管。
如果儲存凍存細(xì)胞的設(shè)備距離水浴較遠(yuǎn)，應(yīng)用干冰進(jìn)行轉(zhuǎn)移，避免凍存細(xì)胞在室溫中暴露太久。
融解搖晃過程中，不可將凍存管管蓋浸入水中，以免水進(jìn)入管中，造成污染。
水浴后不可顛倒或傾斜凍存管，以免造成細(xì)胞損失。
細(xì)胞水浴過程操作要穩(wěn)定快速，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到離心管以及吹打時操作要輕柔緩慢，切勿快速吹打剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞。
減少棄上清后的液體殘留，以保證計數(shù)的準(zhǔn)確性，但去上清時不可吸到管底細(xì)胞。
復(fù)蘇后細(xì)胞會在一個小時左右恢復(fù)到最佳狀態(tài)，如需對細(xì)胞進(jìn)行損傷性處理，請等待細(xì)胞活性達(dá)到最佳后進(jìn)行。
如需將細(xì)胞放置較長時間才能進(jìn)行實驗，則加入復(fù)蘇培養(yǎng)基至10mL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置或搖床上震蕩。
應(yīng)按本說明進(jìn)行復(fù)蘇操作，且復(fù)蘇操作過程不能有時間停頓，以保證細(xì)胞活性。
